En 1927, Charles B. Mintz, que se había casado con Margaret Winkler y había tomado las riendas de su negocio, solicitó una nueva serie de películas, sólo de animación, que serían distribuidas por Universal Pictures de Carl Laemmle. La nueva serie, "Oswald el conejo afortunado", fue un éxito casi instantáneo. El personaje fue creado y dibujado por Iwerks. Su éxito permitió el crecimiento del estudio, y Walt pudo contratar a Harman, Ising, Maxwell y Freleng, de Kansas City.
En febrero de 1928, Disney viajó a Nueva York para negociar un nuevo acuerdo económico con Mintz, pero se llevó una gran sorpresa cuando éste le anunció que no sólo iba a pagarle menos por cada cortometraje que produjera, sino que tenía a los principales animadores de Disney —incluyendo a Harman, Ising, Maxwell y Freleng (pero no a Iwerks)— bajo contrato, y que crearía su propio estudio si Disney no aceptaba trabajar por menos dinero. Los derechos de Oswald pertenecían a Universal y no a Disney, y podían hacer las películas sin él. La compañía de Disney sólo recuperó los derechos sobre Oswald 78 años después, en el 2006.
Tras perder los derechos sobre Oswald, Disney optó por crear un nuevo personaje. Se discute si la primera idea del ratón animado (que básicamente era igual que Oswald, pero con orejas redondas en lugar de alargadas) fue de Disney, a quien suele atribuírsele, o de Iwerks. En todo caso, ambos participaron en la creación del personaje. Sus primeras películas fueron animadas por Iwerks, cuyo nombre se destaca en los títulos de crédito. El ratón iba a llamarse en un principio "Mortimer", pero más tarde fue bautizado como "Mickey Mouse" por su mujer, Lillian Disney.
La primera aparición cinematográfica de Mickey tuvo lugar en Plane Crazy, un cortometraje mudo. Tras no conseguir interesar a los distribuidores por Plane Crazy ni por su continuación, The Gallopin' Gaucho, Disney creó una película sonora, Steamboat Willie. El empresario Pat Powers proporcionó a Disney tanto la distribución de la película como el Cinephone, un sistema de sincronización de sonido. Steamboat Willie se convirtió en un gran éxito, y se añadió sonido a los cortos anteriores. Desde entonces, todas las películas de Disney serían sonoras. El propio Disney se encargó de los efectos vocales de sus primeros cortometrajes y fue la voz de Mickey Mouse hasta 1947.
En enero de 1930 fue adaptado al cómic, en una tira de prensa con guión de Disney y dibujos de Iwerks. Durante la década de 1930, el mercado se inundó de productos relacionados con el personaje, desde juguetes infantiles y relojes de pulsera hasta un brazalete de diamantes diseñado por Cartier.
Además de los cortometrajes de Mickey Mouse, en 1929 Disney inició una serie de películas musicales titulada "Silly Symphonies" ("Sinfonías tontas"). La primera se tituló The Skeleton Dance ("La danza de los esqueletos"), y fue enteramente dibujada y animada por Iwerks, que fue también el responsable de la mayor parte de las películas producidas por Disney en los años 1928 y 1929. Aunque ambas series tuvieron un gran éxito, el estudio Disney no estaba de acuerdo con compartir las ganancias con Pat Powers, y firmó un nuevo contrato de distribución con Columbia Pictures.
Iwerks se estaba cansando de la posición subalterna que tenía en el estudio a pesar de realizar la mayor parte del trabajo, y se dejó convencer por Powers para abrir su propio estudio con un contrato exclusivo. Disney buscó desesperadamente a alguien que pudiera reemplazarlo, ya que él mismo no era capaz de dibujar tan bien, ni —sobre todo— tan rápido (se dice que Iwerks hacía más de 700 dibujos al día para los cortos de Mickey).
Disney contrató a varias personas para hacer el trabajo que Iwerks era capaz de hacer en solitario. En 1932, Disney estrenó su primera película en color, Flowers and Trees, de la serie "Silly Symphonies", que consiguió el Oscar al mejor cortometraje de animación en 1932. Ese mismo año, Disney recibió también un Oscar honorífico por la creación de Mickey Mouse, cuyos cortometrajes pasaron a realizarse en color a partir de 1935. Pronto aparecieron series derivadas, protagonizadas por nuevos personajes, como el Pato Donald, Goofy y Pluto.